الوصف
وع المنتج: غير مقترن
دورة التسليم: بقعة
العدد: 3000 مرة
مقدمة المنتج
تحتوي مجموعة أدوات الكشف عن صلاحية الخلايا CCK-8 على WST-8 (2- (2-ميثوكسي-4-نيتروفينيل) -3- (4-نيتروفينيل) -5- (2،4-ديسلفو بنزين) -2 ملح أحادي الصوديوم تيترازول) . في وجود ناقلات الإلكترون ، يتأكسد WST-8 ويختزل بواسطة نازعة الهيدروجين داخل الخلايا لإنتاج أصباغ فورمازان ذات اللون البرتقالي والأصفر القابلة للذوبان في الماء والتي يمكن إذابتها في وسط زراعة الأنسجة. كمية فورمازان تتناسب طرديا مع عدد الخلايا الحية. طريقة CCK-8 هي طريقة الكشف اللوني غير المشعة شديدة الحساسية تستخدم لتحديد عدد الخلايا الحية في تجارب تكاثر الخلايا أو السمية ، والتي يمكن أن تحل محل طريقة MTT التقليدية.
أحضر أدواتك وكواشفك خارج المجموعة
الطرد المركزي منخفض السرعة ، قارئ الصفيحة الدقيقة (الطول الموجي 450 نانومتر) ، شاكر الألواح ، الماصة الدقيقة ، لوحة الاستزراع 96 بئر ، حاضنة ثاني أكسيد الكربون
خطوات
1. عادةً ما يتم إضافة 100ul (2000 خلية) لكل ثقب لتجارب تكاثر الخلايا ، أضف 100ul (10000 خلية) لكل ثقب لتجارب السمية الخلوية (يعتمد العدد المحدد للخلايا المستخدمة في كل ثقب على حجم الخلايا وسرعة تكاثر الخلايا ، وما إلى ذلك) تحدد العوامل). قبل احتضان لوحة الثقافة في حاضنة لمدة 24 ساعة (عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
2. وفقًا لاحتياجات التجربة ، قم بزراعة وإعطاء 0-10ul تحفيز دوائي محدد.
3. احتفظ بلوحة الاستنبات في الحاضنة لفترة زمنية مناسبة (على سبيل المثال: 24 ساعة أو 48 ساعة).
4. أضف 10ul محلول CCK-8 لكل بئر. إذا كان حجم الثقافة الأولية هو 200ul ، فيجب إضافة 20ul من محلول CCK-8 ، ويمكن استنتاج الباقي عن طريق القياس. يمكن استخدام الآبار ذات الكميات المقابلة من وسط زراعة الخلايا ومحلول CCK-8 ولكن لا توجد خلايا كعنصر تحكم فارغ. إذا كنت قلقًا من أن الأدوية المستخدمة ستتداخل مع الاختبار ، فأنت بحاجة إلى ضبط الآبار بالكمية المقابلة من وسط زراعة الخلايا والأدوية ومحلول CCK-8 ولكن ليس الخلايا المضافة كعنصر تحكم فارغ. (حاول ألا تولد فقاعات في الحفرة)
5. احتضان لوحة الثقافة في الحاضنة لمدة 1-4 ساعات.
6. قم بقياس الامتصاصية عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة.
7. إذا كنت لا ترغب في قياس قيمة OD مؤقتًا وتخطط لقياسها لاحقًا ، فيمكنك إضافة 10 ميكرولتر من محلول HCl 0.1 M أو محلول SDS بنسبة 1 ٪ (W / V) لكل بئر ، وتغطية لوحة الثقافة لتجنب ضوء وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. لن يتغير الامتصاص خلال 24 ساعة.
نتيجة الحكم
(1) معدل بقاء الخلية: اطرح قيمة OD الخلفية من قيمة OD لكل بئر اختبار (وسط كامل بالإضافة إلى CCK-8 ، ولا توجد خلايا) ، وأخذ متوسط ± SD لقيمة OD لكل بئر متكرر.
يتم التعبير عن معدل بقاء الخلية على أنه T / C ٪ ، و T هي قيمة OD للخلايا المضافة للعقاقير ، و C هي قيمة OD لخلايا التحكم. معدل بقاء الخلية ٪ = (OD للخلايا المضافة للعقاقير / OD لخلايا التحكم) × 100
(2) أوجد تركيز الدواء عند T / C = 50٪ (IC50) أو تركيز الدواء عند T / C = 10٪ (IC90).
شروط التخزين: 4 ℃ محمية من الضوء صالحة لمدة سنة
احتياطات
1. انتبه إلى أن تعليق الخلية يجب أن يكون مختلطًا أثناء التلقيح لتجنب ترسب الخلايا ، مما يؤدي إلى عدم تكافؤ عدد الخلايا في كل بئر ، يمكنك مزجها في كل مرة تقوم فيها بتلقيح عدة آبار. من السهل تطاير وسط الاستزراع في دائرة من الثقوب حول لوحة الثقافة. من أجل تقليل الأخطاء ، يوصى بإضافة PBS متوسطة أو معقمة فقط إلى كل ثقب على الجوانب الأربعة للوحة الثقافة ، وليس كثقب للكشف عن الفهرس.
2. يخضع أفضل وقت استجابة لـ CCK-8 لأفضل وقت لتطوير لون معين. عند إجراء التجربة لأول مرة ، يوصى بعمل عدد قليل من الآبار لمعرفة العدد الأمثل للخلايا الملقحة ووقت الحضانة الأمثل بعد إضافة كاشف CCK-8. في ظل الظروف العادية ، تكون خلايا الدم البيضاء أكثر صعوبة في تطوير اللون ، لذا يلزم وقت رد فعل أطول لـ CCK-8 أو زيادة عدد الخلايا (~ 105 خلية / بئر). يصعب تطوير لون الخلايا المعلقة مقارنة بالخلايا الملتصقة. بالنسبة لخلايا التعليق ، بعد إضافة CCK-8 والاحتضان لمدة 1-4 ساعات ، يمكن إخراجها من الحاضنة أولاً ، ويمكن ملاحظة درجة التلوين بصريًا أو تحديدها باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية لتحديد أفضل وقت حضانة لـ CCK -8. إذا كان من الصعب تطوير اللون ، ضع لوحة المزرعة مرة أخرى في الحاضنة واستمر في الحضانة لبضع ساعات قبل القياس. بالنسبة للخلايا الملتصقة ، يكون وقت حضانة CCK-8 بشكل عام 1-4 ساعات. يمكن ملاحظة معظم الخلايا بصريًا بعد 30 دقيقة من الحضانة ، ويكون تأثير الكشف أفضل عندما يتم تحضينها لمدة 2-4 ساعات.
3. يعتمد اكتشاف هذه المجموعة على التفاعل المحفز بواسطة نازعة الهيدروجين. إذا كان هناك المزيد من عوامل الاختزال في النظام ليتم اكتشافها ، على سبيل المثال ، ستتداخل بعض مضادات الأكسدة مع الاكتشاف ، فحاول إزالتها. لا يؤثر الوسيط المحتوي على أحمر الفينول على تحديد قابلية بقاء الخلية في هذه المجموعة.
4. كيف تحدد ما إذا كان الحل المراد اختباره قابل للاختزال؟ أضف 10 ميكرولتر من محلول CCK-8 إلى آبار محلول الاختبار بدون خلايا ، واحتضانها لمدة 1-4 ساعات ، وقياس الامتصاصية الفارغة عند 450 نانومتر. إذا كانت الامتصاصية صغيرة ، فهذا يعني أن هناك عامل اختزال أقل في النظام المراد اختباره ، ويمكن إضافة CCK-8 مباشرة في الاختبار الرسمي ؛ إذا كان الامتصاص كبيرًا نسبيًا ، فهذا يعني أن هناك المزيد من عوامل الاختزال في النظام المراد اختبارها ، ويتم اختبار النظام المراد اختباره رسميًا. في هذه الحالة ، من الضروري إزالة الوسط ، وغسل الخلايا مرتين بالوسيط ، ثم إضافة وسط جديد و 10 ميكرولتر CCK-8 للكشف.
5. إذا كانت العينة عبارة عن تعليق خلية ذات عكارة عالية ، فمن المستحسن تعيين 600 نانومتر (أو أكثر من 600 نانومتر) كطول موجي مرجعي وطرح قيمة O.D للطول الموجي المرجعي.
6. يرجى ارتداء معطف المختبر والقفازات للتشغيل مرة واحدة.
